47843_ELISA样本制备指南及注意事项
试管婴儿，顾名思义说明这些小婴儿不是通过正常的精子卵子结合而诞生的婴儿。大家总听说试管婴儿一代技术，试管婴儿二代技术，都到了四代技术了，是不是技术越往后，越先进？
其实不是的，现在试管婴儿技术的一二三四代都在使用，是根据不同条件的情况设计出来的，都可以帮助辅助生殖。1978年，英国胚胎学家罗伯特·爱德华兹与妇产科学家帕特里克·斯特普托经过20年的上百次试验，最终创造出了世界上第一个试管婴儿———路易斯·布朗。布朗就是在第一代试管婴儿技术帮助下来到这个世界的。
第一代试管婴儿技术，又被称为体外受精联合胚胎移植技术，简称IVF。> 它是借助内窥镜或B超，从妇女卵巢中取出成熟卵子，并与精子在试管或堵养皿中一起培养以生成受精卵，受精卵进一步发育成胚胎后，再将胚胎移植到未来母亲的子宫内，使胚胎在母体子宫内继续发育直至成为成熟胎儿，第一代试管婴儿技术形成与发展的目的，是为了解决因为女性疾病原因而导致的不孕症，例如输卵管堵塞，子宫内膜异位等。这些不孕症通常采用辅助生育技术是无法治愈的，因此可以说，IVF技术是人类生殖技术的一个重大突破。 第二代试管婴儿技术也叫胞质内单精子注射技术又称显微受精，简称ICSI，它是IVF技术发展应用中的重要拓展。> ICSI技术特点是通过显微操作技术，直接将单个精细胞注入卵细胞来帮助卵细胞受精。只要取到一个精子就可以使卵细胞受精，提高了卵子受精的成功率。因此它适用那些由于男性精子原因造成的不孕症，如畸形活精子症，精子数目过低，克氏综合症等。 第三代试管婴儿技术又称为着床前胚胎遗传诊断，或叫胚胎筛选。> 随着科学家们对遗传病的深入研究，为了避免遗传缺陷小朋友出生，就提前对精子卵子结合的胚胎进行筛选，从中选择最符合优生学原理的胚胎植入母体，目的在于避免植入存在遗传缺陷风险的胚胎，生出有先天疾病的小孩。这个技术适用于那些想要繁育后代、本身却患有高遗传风险疾病的人群，包括患单基因遗传病(如常染色体隐性遗传病、常染色体显性遗传病和X染色体连锁遗 传病等)和染色体结构畸变。 第四代试管婴儿技术又称为卵浆置换技术，决定人类遗传性的物质存在于精、卵细胞核的染色体上，它决定了生育后代的遗传特性，而围绕细胞核的细胞质，则发挥着营养细胞核、维持细胞生命的作用。> 这种试管婴儿就是针对那些虽有排卵功能，但因为身体条件不好，或者年龄偏大，致使卵子质量不高，活力差的女性。具体方法是将她的卵细胞的细胞核取出，移植到一位年轻、身体健康的女性卵子的细胞浆中，形成一个新的、优质的卵细胞，而它仍旧表达前一位女性的遗传特征，仍旧以前一位女性为“核心”。然后再把这个所造成的卵子和其丈夫的精子在试管中结合成受精卵，重新植入前一位子宫内，这样就生下一个和提供卵细胞浆的“第三者”毫无关系的健康孩子。 现在大家都明白了吧！这些技术均有各自的适应症，下次再听到谁更先进的说法就可以甄别了。 人们总有对试管婴儿的一些担心，比如试管婴儿不是通过自然的天然的方法结合，那在出生时是否会有风险？智商都能正常发育吗？试管婴儿与正常婴儿有什么不同，试管婴儿长大过程中有什么不一样吗？试管婴儿成年之后会和普通婴儿一样吗？ 大家担心的这些问题其实科学家们也有考虑，并且他们进行了许多调查分析， 有许多对比研究表明，无论是在孕育过程中还是试管婴儿出生之后，试管婴儿的孕育周期，出生时的体重，身长，头围一系列新生儿的检查都没有不同，另外还对出生缺陷，出生后的围生期疾病如呼吸窘迫综合征、呼吸暂停、坏死性小肠结肠炎等做了对比调查，也没有任何差异。 另外，在成长过程中，只要正常喂养，出生时健康的试管婴儿能够像正常的婴儿一样，正常发育，健康成长，智商也不会有异常，试管婴儿也拥有和正常人一样的人间体验。至今,全球约有400万试管婴儿降生。长期的跟踪研究显示, 布朗在28岁时自然受孕生下一个男孩。包括布朗在内,不少试管婴儿如今已为人父母。 试管婴儿经过多年的发展，为世界上许多不孕不育的夫妇提供了生育的可能，为许多家庭带来了欢乐希望大家能够正确看待试管婴儿技术，以及那些长大成人的试管婴儿们。 参考文献 [1]米弘瑛,李利,麻新梅,许小艳.试管婴儿新生儿情况分析[J].实用医学杂志,2013,29(04):593-594. [2]韦雪桦.试管婴儿及其健康[J].中华妇幼临床医学杂志,2008,4(06):588-590. [3]张婷,王晓民. 体外受精与试管婴儿——2010年诺贝尔生理学或医学奖简介[J]. 首都医科大学学报,2010,31(05):678-682. [4]彭靖,卢大儒. 试管婴儿技术的发展与探讨[J]. 自然杂志,2010,32(06):338-343+308. [5]. 走进“试管婴儿”[J]. 重庆医科大学学报,2019,44(08):972. [6]王晓琛. 试管婴儿三十年[J]. 医学与哲学(人文社会医学版),2011,32(06):73-75.
ELISA样本制备指南及注意事项
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定义及介绍
ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）是最基础的免疫学实验之一，其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本，实验操作步骤并不繁琐，但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值，从而供下一步分析所用，因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。
样本制备指南
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血清
全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20min，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品
2.血浆
抗凝剂推荐使用EDTA-Na
2，样品采集后30min内于2-8℃，1000×g离心15min，取上清即可检测。
3组织匀浆/组织全蛋白
用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10min，取上清检测。
其余方法：在分析天平（AL204型）上，称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。
组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要，建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上，较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。
4.细胞提取液
贴壁细胞
用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5min后收集细胞；
悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10
6个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10min，取上清检测。注：留取20μL样本，用于后续BCA测定。
其余方法：
对于
贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。
对于
悬浮细胞：离心收集细胞，以2×10
6细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成（5-10）×10
5细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。
5.细胞培养上清或其他生物体液
收集液体后于2-8℃，1000×g离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注：因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响，不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。
实验细节与注意事项
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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎，释放大量的过氧化物酶，会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶促反应，造成检测结果的不确定性。
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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。
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试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。
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检测样本的稀释推荐多步稀释法，常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍；细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍；建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。
对于稀释倍数比较大的检测样本，参考稀释方案如下：
稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；
稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；
稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；
每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。
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若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。
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若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
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某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。
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对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本，经BCA法测定样本蛋白含量后，建议进行蛋白浓度的统一化，避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差；例如，统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL，进行后续的稀释和检测。